Vědecké pozadí (pouze pro výzkumný kontext)
CYP26B1 je mikrozomální monooxygenáza cytochromu P450, která katalyzuje oxidativní katabolismus all-trans-kyseliny retinové (atRA) a formuje gradienty retinoidů během vývoje i v dospělých tkáních. Základní informace jsou dostupné v záznamu NCBI Gene pro CYP26B1 (člověk), který obsahuje lokus, aliasy a RefSeq záznamy (NCBI Gene). Údaje o proteinu, včetně konzervovaných domén a posttranslačních modifikací, jsou dostupné přes NCBI Protein (NCBI Protein). Chemické a dráhové informace o retinoidech lze nalézt na PubChem (PubChem compound overview). Kurátorsky ověřené kapitoly o drahách jsou uvedeny v NCBI Bookshelf (NCBI Bookshelf).
Pro genomový kontext (koordináty, exon–intronovou strukturu, ortology) využijte UCSC Genome Browser (UCSC Browser). Matice exprese a datasetů lze nalézt v GEO (GEO portal) a surová sekvenační data v SRA (SRA). Kurátorské sady kódovacích sekvencí jsou dostupné v CCDS (CCDS project). Pro návrh primerů a peptidů používejte RefSeq transkripty a proteiny (RefSeq overview).
Další standardy a zdroje
• Směrnice k reportování měření a výkonnosti: NIST (NIST portal)
• Standardy sdílení dat a FAIR principy: NIH Data Sharing (NIH sharing)
• Bezpečnostní pokyny pro práci s RA: NIH OHSRP (NIH OHSRP)
Návrh antigenu a charakteristika protilátky
Typická polykonální protilátka proti CYP26B1 je vytvořena proti peptidu(y) unikátnímu pro CYP26B1 (bez homologie s CYP26A1/CYP26C1). Ověřte, že imunogenní sekvence je z oblasti invariantní mezi izoformami a má nízkou komplexitu (ověření přes Conserved Domain nebo BLAST: BLAST). Predikce topologie a signálních peptidů je dostupná v NCBI Protein (feature tables).
Reaktivita mezi druhy (in silico): Zarovnejte imunogen na ortology (zdroj NCBI Gene, HomoloGene) a ověřte na UCSC multiple alignment (UCSC multiple alignments).
Doporučené výzkumné aplikace (RUO)
Následující pokyny jsou určeny pouze pro výzkumné použití.
Western Blot (WB)
-
Vzorek: ER-lyzáty nebo celkový protein z buněk reagujících na RA.
-
Lýza: RIPA + proteázové inhibitory (UCLA MIMG resources).
-
Nálož: 20–40 µg; pozitivní kontrola (buňky ošetřené RA), negativní (siRNA knockdown).
-
Přenos: SDS-PAGE → PVDF membrána; QC dle univerzitních protokolů (Iowa State lab resources).
-
Primární inkubace: 1:500–1:2000 přes noc, 4 °C.
-
Specifita: Peptidová soutěž nebo knockdown/overexpresní validace.
Základy WB: NIH OITE training (NIH OITE training).
Imunohistochemie – parafín (IHC-P)
-
Fixace: Formalin; antigen retrieval (citrát pH 6 / EDTA pH 9).
-
Kontroly: Bez primární protilátky, případně peptidová soutěž.
-
Interpretace: ER lokalizace signálu; srovnat s RA gradienty (NLM).
Imunofluorescence (IF)
-
Buňky: RA-responzivní linie, ošetřené atRA (PubChem retinoic acid).
-
Permeabilizace: 0.1–0.3% Triton X-100.
-
Mikroskopie: Expozice v lineárním rozsahu (UC Boulder MCDB).
Imunoprecipitace (IP)
-
Beads: Protein A/G; 2–5 µg protilátky / 1 mg lysátu.
-
Detekce: WB nebo LC-MS/MS; standardy: NIH Core Facilities (NIH Core Facilities).
Kontroly a experimentální manipulace
-
Chemická: Indukce CYP26B1 pomocí atRA (PubChem atRA).
-
Genetická: Knockdown/overexpresní validace; ověřte sekvenci přes NCBI Nucleotide (Nucleotide).
-
Tkáňové panely: Výběr podle datasetů z GEO (GEO portal).
Správa dat a reprodukovatelnost
-
Identifikátory: CYP26B1 gen, RefSeq mRNA/protein, CCDS (CCDS).
-
Koordináty: UCSC (UCSC Browser).
-
Reportování činidel: Postupy dle NIST (NIST resources).
Řešení problémů (zkráceně)
-
Slabý signál ve WB → Zvyšte nálož, ověřte přenos, prodlužte inkubaci, zkontrolujte stabilitu protilátky (NIH OITE).
-
Více pásů → Titrační optimalizace, kontrola blokování, ověření sekvencí (NCBI Protein).
-
Vysoké pozadí v IHC/IF → Optimalizace retrievalu, kratší DAB, vyšší stringence mytí, kontrola sekundární protilátky (NLM).
Skladování a manipulace (RUO pokyny)
-
Skladování: Aliquotovat, vyhnout se cyklům zmrazení/rozmrazení (NIH biosafety).
-
Stabilita: Uchovávat na ledu během práce; zbytky zlikvidovat po použití.
-
Bezpečnost: Dodržujte SDS a bezpečnostní pokyny pro azid sodný (NIH OHSRP).
Příklad WB protokolu
-
Kultivujte RA-responzivní buňky, ošetřete 0.1–1 µM atRA 6–24 h (PubChem atRA).
-
Lyze RIPA + inhibitory, kvantifikujte protein.
-
30 µg SDS-PAGE, přenos na PVDF.
-
Blokace 5% BSA; CYP26B1 pAb 1:1000, přes noc.
-
Sekundární HRP 1:5000; ECL detekce.
-
Validace knockdownem (sekvence přes BLAST: BLAST).
-
Reportujte identifikátory a podmínky (NIH sharing).
FAQ
-
Otázka: Jak ověřím identitu pásu?
Odpověď: Knockdown, peptidová soutěž, srovnání MW s predikcí NCBI Protein. -
Otázka: Který exon obsahuje imunogen?
Odpověď: Zadejte peptid jako vlastní track v UCSC (UCSC custom tracks). -
Otázka: Kde najdu datasety s expresí CYP26B1?
Odpověď: Vyhledejte CYP26B1 v GEO (GEO search).
SEO doplňky pro produktovou stránku
-
Doporučené H2: „Protilátka CYP26B1 pro katabolismus kyseliny retinové (RUO)“, „Validováno pro WB, IHC-P, IF a IP“.
-
Alt-text obrázků: „Western blot CYP26B1 v buňkách ošetřených RA“, „IHC barvení CYP26B1 (výzkumné použití)“.
-
Interní odkazy: Další protilátky v RA dráze (např. CYP26A1, RAR, RXR) (NCBI Bookshelf).
-
Strukturovaná data: Použijte Product schema s tagem isAccessoryOrSparePartFor, bez klinických tvrzení.
Upozornění
Protilátka CYP26B1 je určena pouze pro výzkumné použití (RUO) a není určena pro diagnostické účely. Dodržujte bezpečnostní standardy dle NIH (NIH biosafety).